Anna Lange
2016
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Journal
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Abstract
Succinic acid is a highly versatile chemical with the potential of replacing the maleic acid platform currently derived from petroleum. Among the microorganisms suitable for succinic acid production, Basfia succiniciproducens stands out as one of the most efficient commercial producers. In the present work, succinic acid production by B. succiniciproducens from sucrose, fructose, and xylose was analyzed at a systems level by means of 13C metabolic flux analysis. Qualitative 13C tracer studies and in vitro enzymatic assays shed light on so far unknown key properties of the B. succiniciproducens metabolism. Strategies for systems metabolic engineering of B. succiniciproducens were inferred from these results and successfully applied. Compared to other sugars, succinate yields on sucrose and fructose were reduced. This effect could be traced back to the PTS systems responsible for substrate uptake. The beneficial effect of fructokinase, a key enzyme of the B. succiniciproducens sucrose catabolism newly discovered in this work, was exploited to engineer a mutant strain with a tremendously increased succinate yield. Towards utilizing hemicellulose as a raw material, xylose was identified as a promising substrate for succinate production, with formate dehydrogenase possibly involved in superior redox recycling, leading to high succinate yields coupled to reduced by-product formation. Bernsteinsaure ist eine vielfaltig einsetzbare Chemikalie mit dem Potential, die aus Rohol gewonnene Plattformchemikalie Maleinsaure zu ersetzen. Unter den verschiedenen Bernsteinsaure-produzierenden Mikroorganismen sticht Basfia succiniciproducens als effizienter kommerzieller Produzent hervor. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Bernsteinsaurebildung durch B. succiniciproducens auf Saccharose, Fructose und Xylose mithilfe von 13C-metabolischer Flussanalyse auf Systemebene untersucht. Qualitative 13C Markierungsstudien und Enzymaktivitatsmessungen trugen zur Aufklarung bisher unbekannter Eigenschaften des Metabolismus von B. succiniciproducens bei. Aus den Ergebnissen wurden Strategien zur Stammverbesserung mittels Systems Metabolic Engineering abgeleitet und erfolgreich umgesetzt. Die Produktausbeuten auf Saccharose und Fructose waren vergleichsweise gering. Dies konnte auf die fur die Aufnahme der Zucker verantwortlichen PTS Systeme zuruckgefuhrt werden. Der vorteilhafte Effekt der Fruktokinase, eines wichtigen Enzyms im Saccharosekatabolismus von B. succiniciproducens, das in dieser Arbeit erstmals nachgewiesen wurde, konnte zur Konstruktion eines Produzenten mit deutlich erhohter Bernsteinsaureausbeute genutzt werden. In Hinblick auf die Verwendung von Hemicellulose als Rohstoff wurde Xylose als vielversprechendes Substrat identifiziert. Dabei war das Enzym Formiatdehydrogenase in einen vorteilhaften Redoxstoffwechsel involviert, der zu hohen Produktausbeuten fuhrte.